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蛋白质磷脂去除96孔板用于比较四种不同的血浆来源

发布时间:2021-12-28

        
  它是血浆生物分析中常见的基质。但血浆中的磷脂在ESI-MS检测时会导致一系列分析问题,如背压升高、仪器维护需求增加以及以离子抑制形式出现的基质效应等,离子抑制会导致色谱操作过程中出现其他问题,如结果不可重现、信号强度损失、定量不佳等。在本应用简报中,讨论了Microlute  PLR  96孔板的应用,表明在去除磷脂以消除其在分析中引起的问题的同时,可以获得高的可重复回收率。


  它是研究血浆药物代谢和药代动力学(DMPK)的重要基质,广泛用于生物分析。对于DMPK的药物开发,通常通过液相色谱-质谱(LC-MS)来筛选不同的化合物并评估其特性。为了将液相色谱-质谱联用技术应用于药物开发和分析,有必要在将样品注入系统之前对其进行纯化,以消除血浆中的干扰,从而获得可靠和一致的结果。


  血浆的纯化可以在分析前以几种不同的方式进行。最简单的制备方法是蛋白质沉淀法。这个过程包括加入有机溶剂,“盐析”或调节血浆溶液的酸碱度,然后导致蛋白质从溶液中沉淀出来。这是一种快速简单的方法,用于制备溶液,防止蛋白质注入色谱仪器时影响下游应用。然而,这种制备技术不会从样品中去除磷脂,这将导致许多并发症并影响结果。


  磷脂是一种脂质,含有一个磷酸头和至多两个脂肪酸衍生的尾。这使它们两亲。——极性磷酸盐的头部提供亲水性,尾部负责疏水性。磷脂是细胞膜的主要成分,所以在整个人体内无处不在。最常见的磷脂类型是甘油磷脂(主要由甘油磷脂酰胆碱组成)、溶血磷脂和鞘脂,它们占总磷脂的70%(甘油磷脂)、10%(溶血磷脂)和10-20%(鞘脂)。


  在这些磷脂中,有几种常见的磷脂亚类——磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和鞘磷脂。


  众所周知,液相色谱-质谱方法中常用的反相色谱柱(如C8和C18)会因注入色谱柱的样品中的磷脂而缩短色谱柱的寿命。当色谱柱上的疏水官能团与磷脂的疏水尾相互作用时,就会发生这种情况。通常情况下,一些磷脂可能与色谱柱的固定相结合,导致色谱柱的保留容量降低,系统背压增加,色谱柱以随机间隔缓慢流失。可以包含在高有机冲洗中以防止这种情况的发生,但是这将增加分析方法已经很长的时间。磷脂也已知会引起离子抑制。当干扰化合物与被分析物同时从高效液相色谱柱中流出时,这发生在质谱仪源中。共洗脱分子,如磷脂,可以与目标分析物竞争源中的可用电荷,导致更少的分析物被离子化。这将降低分析物的强度,因此会发生信号抑制。磷脂还会影响进入源头的溶剂液滴的蒸发。降低液滴的挥发性可能会增加半径,减少表面积和电荷,从而降低分析物信号的整体强度[3,7]。


  固相萃取是制备血浆样品时去除磷脂的常用方法。清洗步骤可以去除样品中的干扰化合物,并允许洗提更清洁的溶液,以便直接注射到所选系统中,或者干燥并重新配制成合适的溶剂混合物。尽管固相萃取有其优势,但开发一种有效且可重复的去除蛋白质和磷脂的方案可能非常耗时。


  Lute  PLR产品专门设计用于在液相色谱-质谱分析前去除血浆中的蛋白质和磷脂。它提供了一种更快、更简单的方法,可以有效去除血浆中的蛋白质和磷脂,制备注射样品。


  与其他样品制备技术相比,该方法的优势在于开发运行等离子体样品的方法的速度和简单性。该方法的开发非常简单,只需用水稀释粘性样品或在蛋白质分解步骤中调整有机溶剂的体积即可。与固相萃取相比,微萃取PLR去除磷脂为该方法的开发提供了一种更快、更简单的方法,从而以更少的人工操作时间实现更高的通量。


  本应用程序讨论了人、牛、猪和大鼠血浆来源中磷脂的差异,特别是每种类型中磷脂的组成。并且使用Microlute  PLR  96孔板(PPLR025P-001)来分析分析物的回收率并去除每种不同的磷脂。这些来源来自DMPK研究中常用的三种——人、啮齿动物(大鼠)和非啮齿动物(牛和猪)。在这里,我们证明,尽管血浆来源不同,但仍然可以实现可重复的回收和磷脂去除。


  实验

  本应用简报中测试的化合物由两种酸性、碱性和中性分析物组成。这测试了产品的灵活性,以提供独立于化合物分类的良好回收结果。化合物之间存在一系列疏水性,从氢化可的松的1.61到阿米替林的4.92,以测试分析物的疏水性对回收率的影响。


  样品制备方法

  在本申请中,选择人、猪、牛和大鼠血浆。所有血浆都来自适马-奥尔德里奇。对于每种不同的血浆类型,一定体积的血浆被加标至浓度为1。5 g/ml并平衡30分钟。将100升每种加标血浆样品加入到板的六个孔中,并将100升每种类型的空白血浆仅加入到一个孔中作为基质匹配标准。将所有血浆样品与300升含1%甲酸的乙腈溶液混合,移液四次,以确保两种溶液完全混合。用5磅/平方英寸的正压将破碎的血浆溶液洗脱到1毫升收集板(编号219250)中,直到孔完全排空。将收集板中制备的溶液直接注入液相色谱-质谱系统,并使用表2和3中列出的条件进行分析。


  结果和讨论

  色谱显示了该方法的色谱图,仅显示了分析物峰。整个过程没有主干扰峰。由于从收集板注入75%乙腈溶液,早期洗脱峰略有拖尾。这可以通过用水稀释或干燥并在洗脱强度较低的溶液中重构来改善。出于本申请的目的,没有进行该操作,因为液相色谱方法显示出良好的注射重现性,并证明其可以快速塌陷、洗脱和注射到系统中,并获得高且可重现的回收率。


  色谱显示了使用蛋白质沉淀样品的方法的磷脂峰。这些峰分离得很好,大多数没有干扰。猪血浆在34:1 SM峰有一个肩峰,可能是异构体的存在。因为使用单个四极杆仪器,这些异构体无法分离。


  血浆比较

  本应用笔记主要关注血浆中常见的六种不同磷脂-16:0 LPC、1833600LPC、3433601sm、3433602pc、3633602pc和3833604pc。这些范围从16:0 LPC的LogP  5.6到3833604 PC的14.1[9]。由于疏水性低,短链磷脂(1633600和18:0 LPC)最有可能与分析物共流动。长链磷脂更有可能粘附在高效液相色谱柱上和/或以不规则的间隔洗脱,导致意想不到的峰和基质效应。


  对于这种应用,显示每个样品中每个磷脂含量的相对差异是有用的。表4显示了每种蛋白质沉淀血浆样品中磷脂的不同相对组成,绘制的值用于图6中的比较。根据这些值,每个不同血浆样品的成分可以相互比较。


  这有助于解释去除不同磷脂的困难,它们干扰电离的可能性,或者它们是否更有可能导致液相色谱柱上的堆积问题。例如,疏水性较低的磷脂含量较高(16:0或18:0 LPC)表明,它不太可能导致液相色谱柱堆积,但更有可能被分析物洗脱。另一方面,疏水磷脂含量高的相反情况可能最终导致它们与液相色谱柱结合。磷脂去除


  磷脂的去除是生物分析中的一个重要考虑因素,因为它具有以下优点:

  因为减少了基质效应,这导致了该方法更高的重现性。可重现性方法意味着待测样品较少,因此我们对分析结果有信心。

  由于减少了离子抑制,该方法更加灵敏。这允许在分析过程中使用更少的样本。

  通过减少吸附在固定相上的磷脂延长色谱柱寿命。

  减少污染的基质成分进入源头,最大限度地减少维护停工时间。


  表5显示了每个测试血浆样品的磷脂去除率。去除所有高度疏水的磷脂。对于这两种溶血磷脂,猪和人血浆的去除率最低,为99.4%。通过用表4中分析的磷脂组成对每次去除进行加权来计算总磷脂去除量。该数据表明,四个样品中的每一个都实现了磷脂去除。


  回收率

  图7中显示了经微量plr  96孔板处理的每个血浆中分析物的回收率。绘制的每个值是注入液相色谱-质谱系统的六个重复的平均回收率。分析物是一系列疏水性酸性、碱性和中性化合物的混合物——化合物详情见表1。所有回收率均大于90%,表明Microlute  PLR非常有效且重现性好,可以在不影响磷脂去除的情况下获得较高的回收率。


  再现性

  孔隙再现性是提供数据可靠性的重要指标。%RSD值越低,结果的重现性越好。当验证方法时,色谱分析方法通常有10-15%相对标准偏差极限的指导方针。


  显示了可再现的数据。数据范围从牛血浆中阿米替林的0.88%相对标准偏差到猪血浆中酮洛芬的5.74%相对标准偏差。数据显示,四种血浆中每种分析物的重现性都符合药物开发生物分析方法验证过程中选择的标准和典型的%相对标准偏差指南。


  总结

  Microlute  PLR  96孔板是一款使用方便、解决方案快捷的产品。它为一系列具有不同磷脂成分和特性(粘度和蛋白质含量)的血浆样品提供完全的磷脂去除,而不影响分析物的回收率或重现性。

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