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高效液相色谱仪诊断基线噪音

发布时间:2021-07-30

                 
  高效液相色谱中最有用的诊断方法之一是检测器在洗脱液流动时产生的基线的性质。虽然很多基线特征是常见的——,如漂移和非典型调节周期(脉动)——,但可以说基线噪声更常见,可能来自各种来源。此外,根据仪器配置,了解什么是“正常”基线,而不是异常基线水平非常重要。


  如何才能让嘈杂的基线安静下来?


  高效液相色谱输出的信噪比通常通过检测器信号与固有背景信号的比值来测量。这是系统中“正常”噪声的一个有用的度量。固有噪声或背景噪声通常在基线的预定义部分进行测量,大多数数据系统都可以进行这种测量并报告结果。


  当系统中的固有噪声或背景噪声异常高时,会影响系统的性能,通常会导致定量限和可再现积分的增加。这就是为什么作为色谱学家,我们对高于预期的噪音水平如此紧张。


  最小的可检测信号通常被估计为相当于平均基线噪声高度——的三倍,这将使得检测器的“检测极限”信噪比为:1。如果注入的分析物的量小于该值,则信号不再能与噪声区分开。对于定量分析,建议“定量限”的信噪比(S/N)为1033601。


  在计算检测器灵敏度时,分析物信号——的大小不能单独使用,即检测灵敏度通常根据“信噪比”来定义,信噪比是分析物信号与基线变化之比的测量值。信噪比的测量通常由数据系统完成。


  


  当一种方法(或仪器)表现良好时,首先需要建立信噪比,最好是针对每种方法和一组仪器条件。也许这将扩展到确定系统适用性性能标准(通常是一个范围或一个可接受的下限)。


  当然,有经验的色谱分析师可以通过查看基线来知道固有噪声是否“正常”。但这只是经验带来的。还应注意在合理的屏幕放大率或信号衰减下评估噪声,因为在正确的放大率下,任何基线都可能出现噪声!


  


  然而,数据系统可能会通过报告所谓的峰峰值噪声来再次帮助我们,该噪声可以用吸光度单位来表示。这是正常基线部分变化的度量——,而不是信号高度的比率——,并且在确定背景噪声的可接受极限时非常有用。大多数高效液相色谱检测器将运行噪声测试评估,作为其初始化程序的一部分。否则,他们可以使用美国材料试验学会标准来测试长时间流过流动池的高效液相色谱级水。可接受的噪音水平规格将在制造商的说明书中给出。


  虽然它通常与检测器现象有关,但高效液相色谱结果中的噪声有许多因素。我们现在只研究一些主要罪犯。根据问题根源的性质,噪声可以是随机的和周期性的。这种差异本身可以为我们提供一些关于问题本质的线索。


  检测器噪声


  电子和杂散光噪声


  每个探测器都有背景电子和杂散光噪声,通过用绝缘材料屏蔽光学工作台,可以将这些噪声保持在最低水平。检测器固件中的内置测试应保持在最低限度,如果这些测试在启动时失败,仪器将被标记。这是不时重启检测器电源的一个很好的理由,尤其是如果您实验室的做法是在不使用时保持检测器开启。


检测器波长和采集设置


较低的波长设置 (<220nm) 将显示噪声增加,这与溶剂(MeOH 吸收高达 201nm)和缓冲液相关,这会降低落在光电二极管阵列上的光量。探测器的噪声与落在光电二极管上的光量成反比;因此,任何其他减少落在光电二极管上的光量的因素也会增加输出中的噪声。通常,这可能包括老化的灯或脏的流通池窗口。


  这些问题可以通过以下方式克服:


  根据制造商的说明清洁或更换流动池窗口
  执行灯强度测试(使用车载诊断)以评估灯性能,必要时更换灯
  用乙腈代替甲醇作为有机改性剂(甲醇截止波长为210纳米)
  避免使用高吸收缓冲液和添加剂,包括(括号中显示了10毫米溶液的紫外截止值)TFA(0.1% TFA在214     纳米处的吸光度远低于210纳米、柠檬酸盐(230纳米)、乙酸盐(210纳米)和甲酸盐(210纳米))
  根据所用溶剂的可压缩性,泵的可压缩性和冲程容积被优化以最小化噪音


  


  大多数二极管阵列紫外探测器都有一个“狭缝宽度”设置,它描述了光线通过流动池后聚焦在光电二极管上的狭缝宽度。随着狭缝宽度的增加,光变得更加漫射,并且每个波长落在多个光电二极管(对应于狭缝宽度设置)上。这降低了基线噪声并增加了信号强度,从而在定量分析物时实现了更高的分析灵敏度。然而,定性分析所需的光谱分辨率(如通过库匹配进行峰值跟踪)会丢失,这需要更窄的狭缝宽度设置,因此光的漫射更小,每个波长落在更少数量的二极管上。当狭缝宽度减小时,噪声水平增加。始终根据分析要求设置狭缝宽度。


 


  根据以下关系,检测器采集速率和数据聚集也可能对信号噪声产生深远影响


  检测器采集速率和数据聚合


  其中n是数据点数。简而言之,我们进行的测量越多,就越能更好地模拟与仪器响应变化相关的随机变化,这意味着可以更有效地解决噪声问题。仔细平衡信噪比和实际产生的峰峰值噪声非常重要,这通常通过仪器响应或频率来实现。这需要与每个峰上收集的数据点数量进一步平衡,对于紫外线数据,数据点数量应在20-25或更高的范围内。


  


  如前所述,紫外线中的氘灯使用寿命有限,因此当灯在金属外壳上形成电弧到安装的灯丝时,基线噪音和尖峰会增加。这将产生类似于图8所示的基线外观。必须考虑更换灯泡,以确定尖峰是否由灯泡老化引起。请注意,基线尖峰的其他原因也是可能的,例如检测器中电源或电源板的屏蔽不良。图8:紫外检测灯电弧引起的基线尖峰。


  峰可以与“真实”峰区分开来,因为它们在放大时没有高斯形状。


  其他噪声源


  混合不当


  高效液相色谱紫外检测器容易受到流动相不正确混合的影响。——这些流动相是通过二元或四元泵系统在线形成的。混合不良引起的吸光度变化通常与正弦脉冲有关(在以后的博客中介绍)。然而,在低泵送能力下或当使用添加剂如TFA时,干扰可能类似于噪声,而不是可区分的正弦脉冲。


  图9:用不同混合器获得的紫外吸收信号(214纳米)的比较。使用与图5相同的泵,但现在使用色谱柱(30毫米x  2.1毫米内径安捷伦SB-C18)和梯度洗脱。溶剂A为0.1%三氟乙酸水溶液,溶剂B为0.1%三氟乙酸乙腈溶液,梯度在4分钟内从2%上升到40% B。[1]


  


  虽然现代高效液相色谱仪器设计有高效混合器,但在上述情况下,增加上市后静态混合器或简单的在线过滤器可以显著降低基线噪声。请注意,安装在线混合器导致的额外色谱柱体积可能会对峰宽产生不利影响,尤其是在UHPLC系统中。当评估该方法的信噪比特性时,平衡峰值宽度的任何增加和基线噪声的减少。


  故障四元泵梯度比例阀可以获得非常相似的噪声特性。


  脱气不足


  如果流动相脱气不良,当洗脱液因压力变化进入检测器流动池时,小气泡可能会从流动相中逸出。尽管检测器流动池设计有背压限制,以降低进入流动池时的压降,但流动相的这种“鼓泡”将导致显著的基线噪声,当洗脱液未正确脱气时,这种噪声可能无效。


  


  确保使用在线脱气模块对洗脱液进行正确脱气,在某些情况下,在安装到高效液相色谱系统之前,通过真空脱气。


  把…弄干


  如果高效液相色谱柱含有残留的填充溶剂或与不混溶的溶剂一起使用(例如,在正相模式下),柱的不当清洗将导致与除湿相关的基线噪音增加。


  以方法流速平衡色谱柱数小时,以完全冲洗色谱柱中的任何不混溶溶剂。

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