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生物技术中蛋白质纯化的方法

发布时间:2021-07-21

           


生物技术研究的一个重要组成部分是使用蛋白质工程技术来设计或修饰蛋白质。这些蛋白质纯化技术优化了特定工业应用的蛋白质特性。




这些技术要求科学家分离和纯化感兴趣的蛋白质,以便研究它们的构象和底物特异性。同样需要研究的是与其他配体(一种与受体蛋白相连的蛋白质)的反应和特定的酶活性。




所需的蛋白质纯度取决于蛋白质的预期最终用途。对于某些应用,粗提取物就足够了。其他用途,例如在食品和药品中,需要高纯度。几种蛋白质纯化技术用于达到所需的纯度水平。


制定战略
每个蛋白质纯化步骤通常会导致一定程度的产品损失。因此,理想的蛋白质纯化策略是以最少的步骤达到最高水平的纯化。


选择使用哪些步骤取决于目标蛋白质的大小、电荷、溶解度和其他特性。以下技术最适合纯化单个胞质蛋白。


胞质蛋白复合物的纯化更为复杂,通常需要应用不同的方法。


准备粗提物
纯化细胞内(细胞内)蛋白质的第一步是制备粗提取物。提取物将包含来自细胞质的所有蛋白质的复杂混合物,以及一些额外的大分子、辅因子和营养素。




这种粗提物可用于生物技术中的某些应用。但是,如果纯度是一个问题,则必须遵循后续的纯化步骤。粗蛋白提取物是通过去除细胞裂解产生的细胞碎片来制备的,这是使用化学品、酶、超声处理或法式压滤器实现的。


从提取物中去除碎片
通过离心去除碎片,并回收上清液(固体残留物上方的液体)。细胞外(细胞外)蛋白质的粗制品可以通过离心去除细胞来获得。




对于某些生物技术 应用,需要耐热酶——可以耐受高温而不变性,同时保持高比活性的酶。


产生耐热蛋白质的生物有时被称为极端微生物。纯化耐热蛋白质的一种简单方法是通过加热使混合物中的其他蛋白质变性,然后冷却溶液(从而使耐热酶在必要时重新形成或重新溶解)。然后可以通过离心去除变性的蛋白质。


中间蛋白纯化步骤
现代生物技术 协议通常利用许多市售的试剂盒或方法,为标准程序提供现成的解决方案。蛋白质纯化通常使用过滤器和准备好的凝胶过滤柱进行。


按照透析试剂盒的说明,添加正确体积的正确溶液并等待指定的时间,同时在新试管中收集洗脱液(通过色谱柱的溶剂)。




使用色谱方法
可以使用台式色谱柱或自动 HPLC 设备应用色谱方法。HPLC 分离可以通过反相、离子交换或尺寸排阻方法完成,样品通过二极管阵列或激光技术检测。


使用降水
过去,从粗提物中纯化蛋白质的常见第二步是在具有高渗透强度的溶液(即盐溶液)中沉淀。蛋白质沉淀通常使用硫酸铵作为盐进行。通过沉淀与硫酸链霉素或硫酸鱼精蛋白形成的聚集体,可以去除粗提取物中的核酸。


盐沉淀通常不会产生高度纯化的蛋白质,但可以帮助消除混合物中一些不需要的蛋白质,并通过浓缩样品。然后通过多孔纤维素管渗析、过滤或凝胶排阻色谱去除溶液中的盐。


不同的蛋白质会在不同浓度的硫酸铵中沉淀。通常,较高分子量的蛋白质在较低浓度的硫酸铵中沉淀。


蛋白质可视化和纯化评估
反相色谱 (RPC) 根据蛋白质的相对疏水性(从水中排除非极性分子)来分离蛋白质。该技术具有高度选择性,但需要使用有机溶剂。


一些蛋白质会被溶剂永久变性,并在 RPC 过程中失去功能。因此,不建议将这种方法用于所有应用,尤其是在目标蛋白需要保持活性的情况下。


离子交换
离子交换层析是指基于电荷的蛋白质分离。色谱柱可以用于阴离子交换或阳离子交换。阴离子交换柱包含一个带有正电荷的固定相,可以吸引带负电荷的蛋白质。 


阳离子交换和凝胶过滤
阳离子交换柱是相反的、带负电的珠子,可以吸引带正电的蛋白质。目标蛋白质的洗脱(从另一种物质中提取一种物质)是通过改变柱中的 pH 值来完成的,这会导致每种蛋白质的带电官能团发生变化或中和。


体积排阻色谱
尺寸排阻色谱(也称为凝胶过滤)将较大的蛋白质与较小的蛋白质分开,因为较大的分子在色谱柱中通过交联聚合物的速度更快。大的蛋白质不适合聚合物的孔,而较小的蛋白质则适合,并且需要更长的时间通过较少直接的路径通过色谱柱。


洗脱时间
洗脱液(洗脱的结果)收集在一系列根据洗脱时间分离蛋白质的管中。凝胶过滤是浓缩蛋白质样品的有用工具,因为收集的目标蛋白质的洗脱体积比最初添加到柱中的洗脱体积更小。类似的过滤技术可以用于大规模蛋白质生产,因为它们具有成本效益。


亲和色谱和电泳
亲和层析是一种非常有用的“抛光”技术,或完成蛋白质纯化过程。色谱柱中的珠子与与目标蛋白特异性结合的配体交联。


然后通过用含有游离配体的溶液冲洗将蛋白质从柱子中除去。与其他技术相比,此方法可提供最纯净的结果和最高的比活度。


SDS-PAGE
SDS-PAGE(用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的十二烷基硫酸钠)与蛋白质结合,赋予它们大量的净负电荷。由于所有蛋白质的电荷相当相等,因此这种方法几乎完全根据大小将它们分开。


SDS-PAGE 通常用于在一系列的每个步骤之后测试蛋白质的纯度。随着不需要的蛋白质从混合物中逐渐去除,在 SDS-PAGE 凝胶上可视化的条带数量减少,直到只有一个条带代表所需的蛋白质。


免疫印迹
免疫印迹是一种与亲和色谱结合应用的蛋白质可视化技术。特定蛋白质的抗体用作亲和层析柱上的配体。


目标蛋白保留在柱子上,然后通过用盐溶液或其他试剂冲洗柱子来去除。一旦目标蛋白与混合物的其余部分分离,与放射性或染料标记相连的抗体有助于检测目标蛋白。

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